蛙心夹的实验应用

离体蛙心灌流 
 一、【目的要求】   1、学习斯氏离体蛙心灌流法; 2、了解心肌的生理特性;   3、观察Na+,K+,Ca2+及肾上腺素(Adr),乙酰胆碱(ACh)等对离体心脏活动的影响。  
 二、【原理】        将离体蛙心（失去神经支配的蛙心）保持在适宜的环境中，在一定的时间内仍然能够保持节律性收缩，心脏正常的节律性活动需要一个适宜的理化环境，离体心脏也是如此，离体心脏脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响，可以通过改变灌流液的某些成分，观察其对心脏活动的作用。心肌细胞的自律性、兴奋性、传导性及收缩性，都与钠、钾及钙等离子有关。血钾浓度过高时（高于7.9mmol/L），心脏兴奋性、自律性、传导性及收缩性都下降，表现为收缩力减弱、心动过缓和传导阻滞，严重时心脏可停搏于舒张期。血钙浓度升高时，心脏收缩力增强，过高可使心室停搏于收缩期。血钙浓度降低，心肌收缩力减弱。血中钠离子浓度的轻微变化，对心肌影响不明显，只有发生明显变化时，才会影响心肌的生理特性。肾上腺素可使心率加快、传导加快及心肌收缩力增强，乙酰胆碱则与肾上腺素的作用相反。  
三、【实验仪器】   青蛙、 常用手术器械、蛙板(或蜡盘)、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、支架、双凹夹、双针形露丝刺激电极、滴管、培养皿(或小烧杯)、纱布、棉线、橡皮泥、任氏液。蛙心套管(斯氏套管或八木氏套管)、套管夹、0．65％NaCl、5％NaCI、2％CaCl2、1％KCl、1：5 000肾上腺素、1：10 000乙酰肌碱、300U／mL肝素。   
    四、【方法与步骤】  1、斯氏蛙心插管法   （1）一只青蛙，双毁髓后背位置于蜡盘中，按前面的方法暴露心脏。仔细识别心脏周围的大血管(见右图)。在左主动脉下方穿一线，于动脉圆锥处结扎(动物个体小时，结扎位置可靠上些)。再从左右两主动脉下方穿一线，并打一活结备用。左手提起主动脉上的结扎线，右手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉上壁剪一斜口。选择大小适宜的蛙心套管，然后将盛有少量(套管内2～3 cm高度)任氏液(内加入一滴肝素溶液)的斯氏蛙心套管，山开口处插入动脉圆锥(见右图)。当套管到达动脉圆锥基部时，应将套管稍稍后退，使向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进，经主动脉瓣插入心室腔内(于心室收缩时插入，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管下口)。此时可见套管中血液冲人套管，并使液面随心脏搏动而亡下移动，表明操作成功(否则需退回并重新插入)。用滴管吸去套管中的血液，更换新鲜任氏液。稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管用双结扎紧(不得漏液)，再将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏的，使心脏离体(切勿损伤静脉窦)。用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管内液面高度一致(1.5～2 cm)，即可进行实验。   （2）将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉 (不可夹得过多，以免因夹破心室而漏液)。再将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连（如右图）。注意：勿使灌流液滴到传感器上。调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。  
2、 实验观察   (1)记录正常心搏曲线   (2)改用0．65％NaCI溶液灌流，并作好加药标记，观察心搏变化。待曲线 氏插管装置出现明显变化时，立即吸去套管中的灌流液，同时做好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗2—3次，待心搏恢复正常。注意：换液时切勿碰套管，以免影响描记曲线的基线，同时保持灌流液面一致(以下同)。 观察可得，NaCI溶液会阻遏心脏搏动。   (3) 迅速用新鲜任氏液清洗2～3次，待心搏恢复正常。向套管内加入1～3滴2％CaCI：溶液，观察并记录心搏曲线的变化。当出现明显变化时，立即更换任氏液，待心搏恢复正常(如果恢复迟缓，可多次冲洗)。   (4)同法向套管中加1—2滴1％KCl溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时，同法更换灌流液，待心搏恢复正常。   (5)同法记录套管中加入l～2滴的肾上腺素溶液(1：10 000)后心搏曲线的变化。  (6)同法记录套管中加入1—2滴乙酰胆碱溶液(1：10 000)后心搏曲线的变化。
分析：滴加Na离子溶液后，心跳减弱，这种现象出现的原因是由于灌注液中缺乏Ca2+，当Na＋明显增高时，膜内外钠离子的浓度梯度增大，因此，细胞Na离子内流加快，去极速
度和幅度均增加，导致传导性和自律性增高。同时，Na离子内流的增多促进细胞内Ca2＋
的
外运使细胞内Ca2＋
浓度降低，因此，心肌收缩能力减弱。 
 
3、 滴加2%CaCl溶液 分析：细胞外Ca2＋在细胞膜上对Na＋内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。[Ca2＋]  增高时，Na＋内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。[Ca2 ＋] 增高使Ca2＋内流增多，因此慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性增高，而快反应细胞平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ca2＋内流增多，使心肌收缩能力增强。[Ca2＋ ] 降低时，所引起的变化与高钙时相反。因此加入CaCl2后，心率减少、振幅减少，基线上移。
4、滴加1%KCl溶液分析：滴加1％KCl后的心搏曲线，曲线的频率逐渐减小，愈来愈疏，幅度逐渐下降，zui后停止在基线处，即心脏停博于舒张状态。因为当细胞K+浓度增高时，K+与Ca2+有竞争性拮抗作用，K+抑制细胞膜对Ca2+的转运，使进入细胞内Ca2+减少，心肌的兴奋—收缩偶联过程减弱，心肌收缩力降低。所以心搏曲线振幅减小。 
5、 滴加1：10000肾上腺素溶液分析：滴加肾上腺素后，蛙心收缩增强，心脏舒张*，描记的心搏曲线幅度明显增大。其作用机理是，肾上腺素可与心肌细胞膜上的B受体结合，提高心肌细胞和肌浆网膜Ca2+通透性，导致肌浆中Ca2+浓度增高，使心肌收缩增强。另外，肾上腺素还有降低肌钙蛋白与Ca2+亲和力，促使肌钙蛋白对Ca2+的释放速率增加，提高肌浆网膜摄取Ca2+的速度，刺激Na+与Ca2+交换，使复极期向细胞外排出Ca2+的作用加速，这样，将使心肌舒张速度增快，整个舒张过程明显增强。  
 6、 滴加1：10000乙酰胆碱溶液分析：上图可示，蛙心收缩减弱，心率减慢，zui后出现蛙心停止舒张阶段。其机理为：乙酰胆碱与心肌细胞膜M受体结合，一方面提高心肌细胞膜K+通道的通透性，促使K+外流，将引起：1）窦房强细胞复极时K+外流增多，zui大复极电位值增大；Ik衰减过程减弱，自动除极速度减慢。这两方面因素导致窦房自律性降低，心率减慢。2）复极过程中K+外流增加，动作电位2、3期缩短，Ca2+进入细胞内减少，使心肌收缩减弱；另一方面乙酰胆碱可直接抑制Ca2+通道，减少Ca2+内流，进而使心肌收缩减弱。